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問題解答

沒有信號或信號較弱

預處理條件不合適

解決方法：重新優(yōu)化預處理煮沸時間和消化酶消化時間。

石蠟塊和切片制備不正確

解決方法：檢查樣本固定使用的緩沖液組份和濃度，以及切片條件。

雜交過程組織切片部份或全部風干

解決方法： 檢查雜交條件： ①每張切片滴上充足的雜交液 ②使用我們推薦的疏水筆，其它型號極易脫落 ③片子甩去洗液后，放在加熱板上，馬上滴加雜交液 ④檢查雜交儀的水槽是否加水，蓋子蓋緊，保持雜交時的空間濕度。 ⑤孵育器保持水平放置勿傾斜。 ⑥用專用的溫度計確認平板溫度為40℃ ⑦操作過程不夠迅速引至干燥。

雜交溫度不對

解決方法：用專用溫度計確認雜交溫度40℃。

底物沒有新鮮制備

解決方法：底物稀釋液和底物必須新鮮制備，在10分鐘內使用。

目標基因無表達

解決方法：測試目標基因的生物學陽性片。

目標RNA降解

解決方法：應盡量使用新鮮制備的石蠟樣本，檢查制備步驟合乎規(guī)范。實驗時必須同時檢測一張片子上的某個內參基因（比如PPIB）。 可適當增加反應4的雜交反應時間或者底物顯色時間，但有可能導致背景升高。

信號彌散

雜交過程組織切片部份或全部風干

解決方法： 檢查雜交條件： ①每張切片滴上充足的雜交液 ②使用我們推薦的疏水筆，其它型號極易脫落 ③片子甩去洗液后，放在加熱板上，馬上滴加雜交液 ④檢查雜交儀的水槽是否加水，蓋子蓋緊，保持雜交時的空間濕度。 ⑤孵育器保持水平放置勿傾斜。 ⑥用專用的溫度計確認平板溫度為40℃ ⑦操作過程不夠迅速引至干燥。

洗滌不夠充分

解決方法：消化酶消化后至少用水洗兩次。

底物沒有新鮮配制

解決方法：底物應現(xiàn)配現(xiàn)用。

封片前玻片未干燥

解決方法：應徹底干燥后再封片。

組織形態(tài)問題

前處理方法有問題

解決方法：參照附錄的條件優(yōu)化前處理步驟每一步所需時間。

樣品沒有充分固定

解決方法：新鮮組織應使用10%NBF或4%PFA固定。

切片厚度有問題

石蠟切片必須為5±1μm。

組織脫片

烤片不足

解決方法：實驗前應烤片30-60分鐘。

前處理方法有問題

解決方法：參照附錄的條件優(yōu)化前處理步驟每一步所需時間，控制煮沸溫度和消化酶處理時間，不能過久。

樣本固定，包埋等步驟緩沖液有問題

解決方法：檢查處理包埋步驟。

玻片問題

解決方法：選用我們推薦或驗證過的帶正電荷玻片。

高背景信號

雜交過程組織切片部份或全部風干

解決方法： 檢查雜交條件： ①每張切片滴上充足的雜交液 ②使用我們推薦的疏水筆，其它型號極易脫落 ③片子甩去洗液后，放在加熱板上，馬上滴加雜交液 ④檢查雜交儀的水槽是否加水，蓋子蓋緊，保持雜交時的空間濕度。 ⑤孵育器保持水平放置勿傾斜。 ⑥用專用的溫度計確認平板溫度為40℃ ⑦操作過程不夠迅速引至干燥。

石蠟沒有去除干凈

解決方法：確認二甲苯和酒精充分浸泡洗滌。

洗滌不足

解決方法：每次雜交后應充分洗滌，不能只是浸泡。

玻片問題

解決方法：選用合適的玻片。

組織內源性過氧化物酶異常

解決方法：將預反應A時間延長至30分鐘，或與技術支持聯(lián)系。
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